Yeni Nesil Dizileme

Moleküler Tanı'da Yeni Bir Nefes

Yeni nesil dizileme (YND) teknolojisi her laboratuvarda kullanılabilir, masaüstü şekle girmesi ile birlikte moleküler tanı alanındaki uygulamaları da artmaya başlamıştır. Günümüzde bu amaçla tüm genom, ekzom ve klinik ekzom dizi analizi, çeşitli nadir genetik hastalık panelleri ve tek gen analizleri çok sayıda ve hızlı bir şekilde bir arada çalışılmaktadır.

Tedavi, Tanı ile başlar

Dünyada 7.000 civarında nadir hastalık olduğu bilinmektedir. Bu hastalıkların tanı ve tedavisi için girişimlerde bulunulmakla birlikte, birçoğu için artık genetik tanı testleri geliştirilmekte ya da tüm ekzom dizi analizi ile çözüm sağlanmaktadır.

Moleküler Tanı'da Temel İhtiyaçlar

Hedeflenen bölgeyi % 100 kapsayan hızlı ve optimize kitler

Kaliteli sonuç için okumaların çoğunun ≥ Q30 Phred skorunda dizilenmesi

Güvenilir veri analizi için kullanıcı dostu bir arayüz 

Yönetmelikler, veritabanları ve bilimsel çalışmalar doğrultusunda moleküler tanı raporunun oluşturulması

YND Sistem Karşılaştırması

Kütüphane hazırlığı metodları

DNA çalışmaları için kullanılan kütüphane hazırlığı metodları amplikon dizileme veya prob-yakalama (capture) tabanlı olmaktadır.

Amplikon dizileme

Amplikon dizilemede, hedef bölge PCR ile çoğaltılarak zenginleştirilir ardından dizileme sistemine uygun adaptör ve örnekleri birbirlerinden ayırmak için barkod dizileri eklenir.

Büyük bölgeleri tekli PCR reaksiyonları ile çoğaltmak iş yükünü arttırdığından, amplikon dizilemede multipleks PCR metodu tercih edilmekte, tek gen dizilemeden çoklu panellere kadar PCR tabanlı kütüphane hazırlığı yöntemi kullanılabilmektedir.

Örnek:  Multiplicom MASTR Assay iş akışı

Gen Era ürün grupları arasında yer alan Multiplicom MASTR Assay kitleri amplikon temelli kütüphane hazırlığı metodu ile çalışır. 

Kitler kullanıma hazır, optimize olarak gelir ve barkodlama için de MID (multipleks identifier) dizileri kullanılır. 

  • 1. multipleks PCR reaksiyonu ile hedef bölge çoğaltılır,

  • 2. PCR ile barkod (MID) ve sekans adaptörleri eklenir,

  • Ardından manyetik boncuk pürifikasyonu yapılır

  • Örnekler havuzlanır

  • Florometrik kütüphane kantitasyonu sonrasında örnekler cihaza yüklenir.

Prob - yakalama (capture) ile dizileme

Prob-yakalama metodunda, hedef bölgelere özgü dizayn edilmiş probların, hedefe hibridizasyonu ve ardından zenginleştirilmesi (manyetik boncuk, streptavidin vb..) metoduyla çalışır. Daha büyük gen panelleri, kalıtımsal hastalıklar paneli, klinik ekzom veya ekzom dizilemeleri için tercih edilen yöntemdir. Amplikon dizilemeye göre iş akışı basamakları daha uzundur ancak elde edilen ve dizilenen bölge daha büyük olmaktadır. 

Örnek:  WES by Sophia Genetics iş akışı

Genomik DNA enzimatik parçalanır ve kullanılacak yeni nesil dizileme sistemine uygun adaptörler ve barkodlar eklenir.  

1. "Blocking Oligo"'lar, kütüphanenin adaptör kısımlarını bloke eder ve non-spesifik bağlanmalrı engelleyerek hedeften gelen okuma sayısını ve kaplamını arttırır.

2. Hedef DNA'nın zenginleştirilebilmesi için kütüphane, problar sayesinde hibridize edilir.

3. Streptavidin kaplanmış manyetik boncuklar, probun üzerinde bulunan biyotine bağlanır.

4. Manyet sayesinde hedef bölgeler diğer DNA'dan ayrılır.

Ekzom Dizileme

Ekzom dizileme hakkında bilgi edinmek için linki takip edin

Nadir ama bizimle: günümüzde  7.000 çeşit nadir genetik hastalık, tanı konulmayı beklemektedir.

Quail, MA et.al., A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers, 2017, BMC Genomics