Digital PCR

PCR'den ddPCR'ye 30 yıl

1983'de icat edilen termal döngü cihazı yani PCR, sonucu agaroz jel elektroforezi ile verilen semi-kantitatif bir son nokta yöntemidir (end-point assay). Real-time PCR (ya da qPCR) floresan tabanlı deteskiyon yöntemi ile amplifiye edilen ürünün gerçek zamanlı takip edilebilmesini sağlar. qPCR, bir referans gene göre normalizasyon gerektirdiği için relatif kantitasyon yapabilmektedir. 

Dijital damlacıklı PCR, ya da ddPCR, geleneksel PCR temelinde, DNA'nın bir yağ emülsiyonu içerisinde damlacıklara parçalanması sonucu, teker teker floresan detektör tarafından tespit edilmesi metoduna dayanır. Bu yöntem, teker teker  okuma aldığından örneklerin mutlak kantitasyonunu sağlar ve standart eğriye veya referans gene ihtiyaç duymaz.  

Bio Rad Digital Droplet PCR nasıl çalışır?

ddPCR Avantajları

Kullanım Alanları

  • Mutlak kantitasyon - ddPCR sayesinde standart eğriye ihtiyaç duymadan hedef DNA'nın mutlak kantitasyonu yapar. Böylece ddPCR tekniği, viral yük analizi, mikrobiyal analiz ve hedef DNA'nın miktar tayini için ideal bir yöntemdir. 

  • Yüksek hassasiyet - Küçük miktardaki değişimler (deltaCt) tespit edilebilir, özellikle yüksek kopya sayısındaki CNV'lerde küçük sayıda değişimleri tespit etmek için kullanılır (örneğin 11 kopyadan 12 kopyaya artış gibi).

​​​

  • Düşük reaktif maliyeti - Reaksiyon hacimleri pikolitre ya da nanolitre düzeyinde olduğundan kullanınan düşük reaktif hacimleri ile birlikte maliyet de azalır. 

  • Damlacıkla parçalama - 20µl örnekten 20.000 damlacık oluşturularak, örnek küçük bölmelere ayrılır ve her bir damlacıktan ayrı bir okuma elde edilerek hassasiyet ve doğruluk artar. Bu şekilde düşük varyant fraksiyonuna sahip mutasyonlar da tespit edilebilir.

  • Likit Biyopsi

  • Kopya sayısı değişimi (CNV) 

  • Nadir varyant tespiti ( tümör, viral mutasyon)

  • miRNA gen ekspresyonu analizi 

  • Tek hücre analizi 

  • Patojen tespiti 

  • YND kütüphane (mutlak) kantitasyonu 

  • Non-invazif prenatal tarama (NIPT)